一、系統(tǒng)硬件層面的優(yōu)化

（一）CCD相機(jī)的升級

CCD相機(jī)作為小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)的核心部件，其性能直接影響成像質(zhì)量。在像素設(shè)計(jì)上，大像素點(diǎn)能增加靈敏度，像素面積越大，對光越靈敏，可產(chǎn)生更多信號，例如采用高bin值拍攝時(shí)，大像素點(diǎn)拍攝方法能獲取更多信號，拍攝到微弱發(fā)光點(diǎn)。然而，像素點(diǎn)增大也會降低分辨率，導(dǎo)致圖像清晰度變差甚至出現(xiàn)馬賽克現(xiàn)象；小像素點(diǎn)雖能增加分辨率，但像素點(diǎn)面積越小，感光性能越低，信噪比越低，動(dòng)態(tài)范圍越窄。因此，需在大的像素點(diǎn)和小的像素點(diǎn)之間取得平衡。

動(dòng)態(tài)范圍以bit值表現(xiàn)，深度為16位意味著圖像含有21?種顏色深度的變化，這樣的CCD才能準(zhǔn)確表現(xiàn)所檢測到的熒光信號的微小差異，在圖像上表現(xiàn)出不同的深淺或色彩差異。信噪比的高低對成像質(zhì)量更為關(guān)鍵，其與QE值、讀出噪聲和暗噪聲等因素有關(guān)。溫度與暗電流密切相關(guān)，一般情況下溫度越低，因溫度產(chǎn)生的暗噪聲越低，但當(dāng)溫度降低到一定程度時(shí)，亂真電荷會出現(xiàn)，增加暗電流的值。所以，溫度對于CCD來講并非越低越好，而是存在一個(gè)最佳值，既降低溫度帶來的噪聲，又不引起亂真電荷的增加。

（二）暗箱與麻醉系統(tǒng)的改進(jìn)

暗箱需經(jīng)過特殊設(shè)計(jì)，以有效避免外界光線及宇宙射線對成像的影響。例如，一些先進(jìn)的暗箱采用密封結(jié)構(gòu)，能夠有效阻擋外界光線的干擾，為成像提供穩(wěn)定的環(huán)境。麻醉系統(tǒng)則要確保動(dòng)物在成像過程中處于穩(wěn)定的麻醉狀態(tài)，避免因動(dòng)物活動(dòng)導(dǎo)致成像模糊。例如，采用氣體麻醉方式，能夠精確控制麻醉深度，使動(dòng)物在成像過程中保持安靜，減少運(yùn)動(dòng)偽影的產(chǎn)生。

（三）光源與濾光片的選擇

熒光光路系統(tǒng)采用高功率窄帶寬LED，具有強(qiáng)度更高、壽命更長、光衰更小的優(yōu)點(diǎn)，全局對稱式排列能提供更均勻的光線輸出。數(shù)量眾多的窄帶寬濾光片搭配復(fù)雜的光譜分離算法，能夠?qū)崿F(xiàn)對多種熒光探針的分離，大大減少熒光背景對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。例如，在多通道、多標(biāo)記的熒光成像實(shí)驗(yàn)中，通過合理選擇濾光片，可以有效區(qū)分不同熒光探針的信號，提高成像的準(zhǔn)確性和清晰度。

二、實(shí)驗(yàn)操作層面的優(yōu)化

（一）動(dòng)物模型的準(zhǔn)備

動(dòng)物毛發(fā)處理：動(dòng)物毛發(fā)顏色對成像質(zhì)量有顯著影響，白毛小鼠的自發(fā)熒光最為強(qiáng)烈，黑毛小鼠則可能對信號產(chǎn)生嚴(yán)重遮擋。因此，最佳選擇是使用無毛或白化動(dòng)物品系。若條件受限，可采用脫毛器或脫毛膏對預(yù)期發(fā)光部位或整個(gè)腹部進(jìn)行脫毛處理。例如，在成像前一天，通過剃毛或化學(xué)脫毛清除觀察區(qū)域的毛發(fā)，確保最大程度地收集信號。

動(dòng)物飼料選擇：常規(guī)嚙齒動(dòng)物飼料中含有的紫花苜蓿會導(dǎo)致小鼠腹部出現(xiàn)自發(fā)熒光，其峰值波長約為680nm，可能掩蓋或模擬定位于腹部附近的熒光探針的信號。因此，建議采用無苜?；蚣兓暳?，以迅速降低腸道自發(fā)熒光，提升熒光成像的信噪比。

動(dòng)物體位調(diào)整：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的光學(xué)信號會被組織干擾從而發(fā)生衰減，信號源越深，信號衰減越大。為了達(dá)到最大的模型靈敏度，需確定能夠發(fā)出最高信號強(qiáng)度的動(dòng)物體位和方向。例如，研究者可以從多個(gè)位置拍攝圖像，以確定最佳的動(dòng)物體位和方向。同時(shí)，建議在動(dòng)物之間使用分隔板，防止信號的反射和互相干擾。

（二）成像參數(shù)的設(shè)置

曝光時(shí)間與像素合并：在生物發(fā)光成像（BLI）中，使用適當(dāng)?shù)南袼睾喜ⅲㄈ?×4）和短曝光時(shí)間（5秒）拍攝初始圖像。若未檢測到信號，則使用更高的像素合并（8×8或16×16）以及更長的曝光時(shí)間（從60秒開始，必要時(shí)可延長到600秒）。對于熒光成像（FLI），通常通過從中到高的像素合并（4×4或8×8）和從短到中的曝光時(shí)間（5到30秒）來實(shí)現(xiàn)最好的信噪比（SNR），但要避免長時(shí)間曝光，以免導(dǎo)致來自組織自體熒光所造成的背景噪音升高。

底物注射途徑與劑量：選擇BLI底物注射途徑時(shí)應(yīng)考慮病變部位因素。最常用的是經(jīng)腹膜腔注射（IP）途徑注射D-熒光素，對于全身和皮下疾病模型非常理想。但對于腹膜腔疾病模型，經(jīng)皮下（SC）注射可給出最好的圖像，因?yàn)镮P注射可能導(dǎo)致人為地提高腹膜腔生物發(fā)光信號。靜脈注射（IV）方法可產(chǎn)生更明亮的圖像，但峰值信號的窗口通常僅在注射后2—5分鐘出現(xiàn)，較難捕捉。在D-熒光素的使用上，成像當(dāng)天準(zhǔn)備新鮮的溶液，并給予150mg/kg的IP劑量，以在大多數(shù)小鼠模型中實(shí)現(xiàn)一段時(shí)間的熒光素酶飽和動(dòng)力學(xué)。

（三）成像環(huán)境的控制

清潔處理：動(dòng)物襯墊、食物和皮屑都可能產(chǎn)生背景熒光信號。因此，在成像之前，一定要擦拭凈動(dòng)物爪子，清潔成像平臺，最好用浸透70%乙醇的紙巾擦拭。

溫度控制：哺乳動(dòng)物生物發(fā)光成像中，熒光素酶成像是一種酶和底物的生化反應(yīng)，生物熒光成像不可避免地受到底物濃度和動(dòng)物體溫度的影響。活體成像系統(tǒng)的暗箱和檢測平臺應(yīng)保持良好的恒溫狀態(tài)，以保證動(dòng)物的體溫恒定在37℃。

三、數(shù)據(jù)分析層面的優(yōu)化

（一）光譜分離技術(shù)

Living Image成像和分析軟件具備光譜分離技術(shù)，能實(shí)現(xiàn)組織自發(fā)背景熒光去除及多探針成像。在復(fù)雜的成像實(shí)驗(yàn)中，不同熒光探針的信號可能會相互干擾，通過光譜分離技術(shù)，可以將不同探針的信號準(zhǔn)確分離出來，提高成像的準(zhǔn)確性和可靠性。

（二）動(dòng)力學(xué)曲線建立

生物發(fā)光信號強(qiáng)度反映的是熒光素酶底物的動(dòng)態(tài)變化，這些動(dòng)態(tài)變化作為疾病相關(guān)的病理和生理結(jié)果，通常是組織依賴性的，也可以隨著時(shí)間的推移而變化。在運(yùn)用BLI的研究中，應(yīng)識別生物發(fā)光的峰值并比較其在實(shí)驗(yàn)過程中的經(jīng)時(shí)變化，最好通過在每個(gè)成像時(shí)間點(diǎn)建立生物發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線來實(shí)現(xiàn)。這種曲線是在熒光素注射后的一系列時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，通過對動(dòng)物進(jìn)行注射、麻醉、然后成像來建立的。通常，成像開始于注射后5分鐘，每5—10分鐘重復(fù)一次，并在信號強(qiáng)度開始下降時(shí)結(jié)束。

四、多模態(tài)成像的融合應(yīng)用

多模態(tài)小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)最好同時(shí)具備高靈敏生物發(fā)光成像（BLI）、熒光成像（FLI）、X-射線成像、切倫科夫成像（Cerenkov）以及明場成像功能，能進(jìn)行2D/3D成像和定量分析，并能將多種成像模式進(jìn)行融合展示和進(jìn)一步分析。例如，通過BLI、FLI和明場照片疊加圖像的三模態(tài)成像，可以對生物發(fā)光的腫瘤細(xì)胞與熒光標(biāo)記的治療分子的相對位置進(jìn)行評估；通過生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）成像、熒光素酶和NIR熒光探針共表達(dá)、用熒光素酶活性的共振能量激發(fā)NIR熒光探針，可以實(shí)現(xiàn)低背景的NIR FLI和高SNR的BLI。

提升小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)的成像質(zhì)量需要從系統(tǒng)硬件、實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)分析和多模態(tài)成像融合等多個(gè)層面進(jìn)行優(yōu)化。通過不斷改進(jìn)和優(yōu)化這些方面，可以獲得更準(zhǔn)確、更清晰的成像結(jié)果，為小動(dòng)物活體成像研究提供更有力的支持。